背景介绍
三萜被认为是积雪草中的主要活性成分。如积雪草酸，羟基积雪草酸，积雪草苷，羟基积雪草苷和积雪草苷B（图1）。由于积雪草苷异构体（羟基积雪草苷和积雪草苷B）以及三萜酸和三萜糖苷之间的极性差异很大，很难同时测定五种三萜类化合物。在这项研究中，作者开发了一种简单的高效液相色谱法，采用环糊精（CDs）作为流动相添加剂进行等度洗脱，以确定积雪草中的五种三萜类化合物。研究结果
CDs性质对保留时间的影响
以乙腈-0.2%磷酸（20:80，v/v）混合物为流动相，CDs（α-CD）为流动相，研究了羟基积雪草酸，积雪草酸，积雪草苷，羟基积雪草苷和积雪草苷B在C18柱中的保留行为。（α-CD，β-CD，Glu-β-CD，HP-β-CD和γ-CD）作为添加剂。积雪草甘B和羟基积雪草甘在60分钟内洗脱，但其他三萜类化合物强烈保留在色谱柱上。分钟内未使用不含CDs的流动相洗脱（图2A）。使用α-CD作为流动相添加剂在分钟内洗脱积雪草苷B和羟基积雪草苷（图2B），并使用β-CD，HP-β-CD或Glu-β-CD用作流动相添加剂在分钟内洗脱三种三萜（积雪草苷B，羟基积雪草苷和积雪草苷），（图2C，D，E）。幸运的是，使用γ-CD作为流动相添加剂，在30分钟内洗脱了5种三萜类化合物（图2F），洗脱顺序为积雪草苷B（5.80分钟），羟基积雪草苷（11.92分钟），积雪草苷（13.83分钟），羟基积雪草酸（15.94分钟）和积雪草酸（25.85分钟）。积雪草苷B和羟基积雪草甘是一对异构化合物。从以前的研究中，异构体由于其相似的特性只能在普通HPLC中成为单峰。在这项研究中，没有CDs添加剂，60分钟内无法实现羟基积雪草苷和积雪草苷B的基线分离。当α-CD，β-CD，HP-β-CD或Glu-β-CD作为流动相添加剂时，积雪草苷B和羟基积雪草甘会完全分离，分辩率见（表1）。此外，β-CD，HP-β-CD和Glu-β-CD可以减少它们的保留时间。但是，上述四种CD不能改变羟基积雪草酸和积雪草酸的保留值。与γ-CD相比，三萜不适合α-CD（或β-CD）的较小空腔，并且不形成包合物。因此，没有用α-CD，β-CD，HP-β-CD或Glu-β-CD作为流动相添加剂洗脱羟基积草酸和积雪草酸。积雪草苷B和羟基积雪草苷的分离改善和保留时间的缩短可归因于CDs（β-CD，HP-β-CD和Glu-β-CD）可与积雪草苷B和羟基积雪草苷中的葡萄糖形成氢键。γ-CD不仅改善了积雪草苷B和羟基积雪草苷的分离，而且还显著降低了五种三萜类化合物的保留时间。这种现象可以通过在γ-CD和五个三萜之间形成包合物来解释。因此，基于分析物之间疏水性的差异，可以通过第二种机制即包合物的形成改善三萜异构体的拆分。另一方面，络合现象增加了它们在流动相中的亲水性，然后显著降低了它们在柱中的保留时间。γ-CD浓度对保留率的影响
γ-CD的浓度是分析物洗脱的控制因素，因为它决定了包合物的形成程度。为了验证γ-CD对五种三萜类化合物保留行为的影响，以含不同浓度γ-CD（20:80，v/v）混合物的乙腈-0.2%磷酸为流动相，计算了五种三萜类化合物的容量因子（k），并构建了k与γ-CD浓度的关系曲线。图3显示，随着γ-CD浓度从1.0mM增加到6.0mM，五种三萜的k值显著下降，三萜酸的含量下降幅度大于三萜糖苷。由于糖苷的部分贡献，三萜糖苷分子体积大，疏水性弱，因此三萜酸/γ-CD复合物比三萜糖苷/γ-CD复合物更稳定，三萜酸在保留中的下降幅度大于三萜糖苷。在30分钟内洗脱5种三萜，当γ-CD浓度为4.0mM时，5种三萜的分离很好。当γ-CD浓度大于4mM时，保留时间太短，三种三萜糖苷的分离不好。积雪草苷B和羟基积雪草苷完全分离，γ-CD浓度为1.0~4.0mM，积雪草苷B和羟基积雪草苷的R值均高于11。因此，流动相中的γ-CD浓度选择为4.0mM。乙腈体积分数对保留率的影响
流动相中有机溶剂的比例会显著影响分析物的保留。为了研究流动相中乙腈对五种三萜保留的影响，选择15-25%（v/v）乙腈。图4显示了使用通过混合适量乙腈和4mMγ-CD溶液制备的流动相获得的五种三萜的k值。当乙腈的体积分数为15%时，积雪草酸在分钟内未被洗脱。当乙腈的体积分数增加时，五种三萜的k值急剧下降，表明五种三萜的保留时间与乙腈浓度成反比。当乙腈的体积分数为25%时，三萜糖苷的保留时间太短，羟基积雪草苷和积雪草苷的分离不好，R值低于1.5。因此，流动相中最合适的乙腈体积分数为20%（v/v）。温度对保留值的影响
温度也会影响分析物的保留和分离。为了验证温度对五种三萜类化合物保留行为的影响，用含有4.0mMγ-CD（20:80，v/v）混合物的乙腈-0.2%磷酸作为流动相在不同温度下进行实验（25°C，30°C和35°C）。图5显示了五种三萜在不同温度下的k值。五种三萜类化合物的k值随温度的升高而增加，这表明五种三萜类化合物的保留时间增加，所以流动相的洗脱能力随温度的升高而减弱。这可能是由于CDs和三萜的包含是一个放热过程，γ-CD和三萜之间包合物的形成不利于处在较高的温度环境。积雪草苷B和羟基积雪草苷在25~35℃的温度下完全分离，积雪草苷B和羟基积雪草甘的R值均高于13。因此，温度稳定在30℃。方法验证
通过在五个三萜的六个浓度水平下进行五次重复进样来进行线性回归分析。通过绘制每种分析物的峰面积与分析物量的关系，构建的五种三萜类化合物的校准曲线在浓度范围内（如表2所示）均表现出良好的线性（r2≥0.）。对5种三萜类化合物分别测定了信噪比（S/N）为3和10的色谱分析下的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。采用等度洗脱HPLC的LOD和LOQ分别为0.5–3ng和1.5–8ng。分别在第1天和第5天通过5次重复注射进样检查5种三萜的日内和日间精密度。C.asiatica样品中五种分析物的日内和日间精密度均小于2%。同时，进行回收试验以检验提取方法的准确性。将准确量的五种三萜类化合物加入到一定量（0.1g）的积雪草粉末中，然后如样品制备中所述提取并分析。分析物的回收百分比计算如下：回收率（%）=(加标试样量－试样量)÷加标量×%。如表2所示，采用γ-CD作为流动相添加剂的开发HPLC方法对C.asiatica样品中的所有五种三萜类化合物在98.2%±1.73%和99.6%±1.37%内具有良好的准确度。应用
采用高效液相色谱法，以γ-CD为流动相添加剂，对积雪草中5种三萜进行分离和测定。典型色谱图如图6所示。用保留时间和UPLC/MS对5种三萜进行了鉴定，积雪草苷B、羟基积雪草甘、积雪草苷、羟基积雪草酸和积雪草酸的保留时间分别为5.80min、11.92min、13.83min、15.94min和25.85min。分析结果汇总见表3。结果表明，5种三萜的含量差异显著。其原因可能是积雪草生长环境、收获季节、气候差异和三萜生物转化的环境导致。建立了同时测定积雪草中5种三萜类化合物的方法。但是，该方法存在以下局限性。高浓度CDs对色谱柱有很大的破坏作用。该方法不适用于有机相比例较高的流动相。讨论与分析
研究结果表明，γ-CD作为一种非常有效的流动相添加剂，可显着降低三萜类化合物（特别是羟基积雪草酸和积雪草酸）的保留率，改善积雪草苷B和羟基积雪草甘的分离。三萜类化合物的保留性质不仅取决于CDs的性质浓度，还取决于三萜类化合物的性质和温度。实验还验证了所提出的具有等度洗脱的HPLC方法，五种三萜在浓度范围内表现出良好的线性（r2≥0.），五种三萜的日内和日间精密度均小于2%。所提出的HPLC方法在C.asiatica样品中的五种三萜类化合物的准确度在98.2%±1.73%和99.6%±1.37%之间。该方法已成功应用于积雪草中五种三萜类化合物的同时测定，为草药质量评价提供了良好的选择。本文于年10月29日在线发表于：《科学报告》，第一作者为王昌河。通讯作者为：刘海静。通讯单位：陕西省食品药品监督管理局，陕西省西安市科技经五路21号，陕西西安765原文链接：
